蛋白质含量是粮食营养品质的重要标志之一,特别是随着目前我国生活水平的不断提高,该指标亦愈来愈被人们所重视。我国测定粮食粗蛋白的现行标准方法为凯氏定氮法(GB5511一85),但传统凯氏烧瓶的方法在对样品消化液蒸馏过程中不仅操作繁琐、费时,而宜需要的仪器设备亦比较特殊、复杂,从而给粮食粗蛋白的测定普及工作带来了诸多不便。本文以全自动凯氏定氮仪高自动化及样品数据稳定性取代传统凯氏烧瓶繁琐操作，为蛋白测定工作提供安全快速的分析方法：

1、 1.目的 测定粮食、粮油制品中粗蛋白的含量
2.范围 含氮量0.02%-95%之间的粮食、油料
3.定义 无
4.职责 检验员负责检验工作的执行
5.作业办法
5.1 晶品JPD200全自动凯氏定氮仪测定法
5.1.1工作原理
JPD200全自动凯氏定氮仪是由消解仪与定氮仪蒸馏器组成。将试样置入消化管插入JPH500红外消解仪内加热取得*的热效应，在消化之前置入催化剂进一步加速消化煮解，大大缩短消化时间。消化管内溢出的SO2等有害气体，通过消化管上的排污管经抽气三通由下水道带入下水道，有效的抑制了有害气体的外溢，试样经60分钟左右消化煮解，即可*消化尽。
5.1.2技术参数
5.1.2.1测定样品量：固体<5g/个，液体<15ml/个
5.1.2.2工作电压：220V，50HZ
5.1.2.3电耗：蒸馏器1600W、消解仪（6孔1500W）(12孔2000W) (20孔2500W)
5.1.3操作方法
5.1.3.1试剂准备
5.1.3.1.1浓硫酸混合液 在100mL水中缓缓加入浓硫酸200mL，冷却后加入30%过氧化氢300mL，混合均匀。
5.1.3.1.2混合催化剂 硫酸铜10g、硫酸钾100g、硒粉0.2g，在研钵中研细过孔径0.45mm（40目筛），混匀备用。
5.1.3.1.3 混合指示剂0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL,0.1%甲基红乙醇溶液7 mL,，密封保存（保存期一个月），PH值4.5—5.5之间，否则应用稀酸稀碱调节；
5.1.3.1.4 20g/L硼酸溶液 称取10g硼酸溶解在1000mL水中。
5.1.3.1.5 400g/L氢氧化钠溶液 称取40g氢氧化钠溶于100mL水中。
5.1.3.1.6 0.1mol/L盐酸溶液
5.1.3.1.6.1配置
先配置0.1mol/L盐酸，量取9mL浓盐酸，加水定容至1000mL。

5.1.3.1.6.2 0.1mol/L盐酸标准溶液的滴定
称取0.2g于270℃-300℃灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示液，用配置好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。
5.1.3.1.6.3 计算
C(HCL)= 1000×m(V1-V2)×52.994
公式中 C(HCL)——盐酸标准溶液的物质的量浓度，mol/L；
m——无水碳酸钠的质量，g
V1——盐酸溶液的用量，mL
V2——空白试验盐酸溶液的用量，m；
M——无水碳酸钠的摩尔质量，其值为M（1/2Na2CO3)=52.994g/mol。
5.1.3.2样品消化
称取经粉碎通过40-60目的样品0.5-1.0g用蜡光纸卷着倒入已洗涤烘干的消化管中加催化剂5g左右和10mL左右硫酸。将消化管分别放入消化架各个孔内，然后置于消化炉上，然后开启抽气三通接上自来水，使抽气三通处于吸气状态，接通电源，在加热初始阶段注意防止样品飞溅。消解仪温度起先控制在200度左右，20分钟后可以再设定至450度以上。
消化终点是以消化液的颜色来判定的，当消化液呈浅蓝绿色的透明状时，再继续加热沸腾10分钟，然后结束消化过程。
5.1.3.3 蒸馏
5.1.3.3.1蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用独立定量泵加入，NaOH、H2O注入接口用橡胶管套入后分别置入自备的容器中，加液时按面板上运行开关，硼酸溶液、碱液由仪器自动分别添加入滴定杯和消化管内。（一般硼酸加30ML，碱液加入量是消化时硫酸用量的5倍以上，加蒸馏水量15毫升左右）。
5.1.3.3.2 打开电源，打开自来水，接冷却水，自来水不必开过大，出水口有水流出低压开关不报警提示即可，用排水管子上的夹子夹紧排水管子。。
5.1.3.3.3 打开左侧安全防护门把消化管固定在左边托架上，然后按面板上运行按键自动加入溶液，自动蒸馏，根据蒸馏回收液与硼酸反应产生颜色的变化，仪器高精度颜色传感单元与1ul/步高精度滴定单元配合注入盐酸滴定液，直至将回收液滴至灰紫色，在没有氨水蒸馏至滴定杯后仪器自动停止滴定，并根据内置计算公式自动计算出结果，根据需要按打印按键打印结果。按下式计算蛋白含量：
蛋白含量（%）=（V-V0）×N×0.014×A×100/W
式中：V——消耗的盐酸的毫升数
V0——空白试验时消耗盐酸毫升数
N——盐酸的当量浓度
0.014——1mL盐酸的克当量数
A——固定系数（6.25、5.7、5.3）
W——试样重量,g

全自动凯氏定氮仪滴定精度高，稳定性好，相比人工滴定节省大量时间而且提高了数据的可靠性。
5.1.3.5关机
关电源、关水、打开安全门取下消化管，擦干机器。
5.1.4注意事项
5.1.4.1 消化时如气体外逸，加大自来水压力。小花圈每次试验结束后清洗一遍延长使用寿命。碱泵每次工作完后把氢氧化钠溶液外接皮管移入蒸馏水瓶内，前面套好消化管抽洗几次，防止碱浓度过高，残留在碱泵内而影响寿命年工也可防止单向阀阀芯粘连。待下次使用时，在蒸馏时须排出100mLNaOH，以防止*个样品NaOH浓度不够。
5.2 传统凯氏烧瓶测定蛋白的分析方法供参考
5.2.1仪器和用具
5.2.1.1 凯氏烧瓶：50ml；
5.2.1.2 圆底烧瓶：100ml；
5.2.1.3 万用电炉；
5.2.1.4 锥形烧瓶：100ml；
5.2.1.5 微量滴定管：5ml、刻度0.01ml；
5.2.1.6 容量瓶：50ml；
5.2.1.7 移液管：5ml；
5.2.1.8 量筒：10ml；
5.2.1.9 洗耳球；
5.2.2 试剂 同上
5.2.3 操作方法
5.2.3.1 消化
称取经粉碎通过40-60目的样品0.2～0.3g（W，到0.0001g），用蜡光纸卷着倒入洗净烘干的50ml凯氏烧瓶中，加混合指示剂1g,同时加入硫酸-过氧化氢-水混合液3～5ml，稍加振摇，斜置于电炉上，在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，勿使瓶中泡沫超过瓶肚的三分之二，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。消化到溶液呈浅蓝绿色的透明状时，再继续加热沸腾10min，取出待消化液冷却至室温后，加水10～20ml，再待溶液温度降到室温后，干净地转入50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀备用。同时做空白实验。
5.2.3.2 蒸馏
在烧瓶内加水400ml和少量沸石，加5滴混合指示剂，加几滴酸液使水呈紫红色，连接蒸馏装置，并检查有无漏气处。
量取30ml1%硼酸溶液注入锥形瓶内，加混合指示剂2滴，使冷凝管下端插入液面下1cm处。量取稀释的消化液5ml，由漏斗注入蒸馏瓶内，再加水10ml，冲洗加液漏斗。量取40%氢氧化钠溶液1ml，提起活塞注入蒸馏瓶内，立即用水2～5ml冲洗漏斗，旋紧活塞。这时蒸馏瓶内溶液总体积不要超过其容量的一半。
打开簧夹，关闭活塞，加热烧瓶，待蒸馏瓶内溶液开始沸腾时开始计时，经2min降低锥形瓶，使冷凝管下端露出液面，再蒸馏1min后，用水冲洗管下端。
蒸馏结束后，掐紧簧夹，断绝蒸气，使蒸馏瓶内溶液全部吸入回流管中，放松簧夹，从漏斗加入蒸馏水40～50ml，再通蒸气加热和回流，将蒸馏瓶洗涤一次备用。
5.2.3.3 滴定
用0.01 mol/L盐酸溶液滴定锥形瓶内的吸收液，滴定溶液出现浅紫红色为止。同时做空白实验。
5.2.4 结果计算
粗蛋白质的干基含量按下列公式计算：
粗蛋白质（干基%）= （V1-V0）×N×14×P×50v ×10000W(100-M)
式中：V——蒸馏时取用稀释的消化液体积，ml；
V1——实验用去的盐酸溶液体积，ml； 1
V0——空白试验用去的盐酸溶液体积，ml；
N——盐酸溶液的当量浓度，N；
14——每毫克当量盐酸相当于氮的毫克数；
P——蛋白质换算系数（小麦5.7，其他谷物及豆类6.25）；
W——试样重量，mg；
M——试样水分百分率，%。
5.2.5 注意事项
5.2.5.1 消化过程中若硫酸损失过多，可酌情补加硫酸，勿使消化瓶内干涸。
5.2.5.2 加入蒸馏瓶内的碱液必须过量。
5.2.5.3 消化液加水稀释后，应及时进行蒸馏。